Méthodologies en RMN

La RMN multidimensionnelle conventionnelle nécessite une durée d’expérience qui empêche son utilisation pour la caractérisation de phénomènes rapides ou l’étude d’un grand nombre d’échantillons. Nous développons de nouvelles séquences de RMN ultrarapide, qui utilisent un encodage spatial des interactions RMN pour obtenir des spectres multidimensionnels en moins d’une seconde. Nous avons notamment étendu cette technique au cas des expériences « multi-quanta », et nous développons des expériences de RMN diffusionnelle ultrarapide. Ces méthodes présentent des caractéristiques favorables pour l’étude des mélanges. Nous développons également des outils de simulation permettant d’analyser les expériences de RMN ultrarapides.

Publications:

• L. Guduff, I. Kuprov, C. van Heijenoort and J.-N. Dumez, Spatially encoded 2D and 3D diffusion- ordered NMR spectroscopy, Chem. Commun., 53, 701 (2017). http://dx.doi.org/10.1039/C6CC09028A
• A. Le Guennec, P. Giraudeau, S. Caldarelli and J.-N. Dumez, Ultrafast double-quantum NMR spectroscopy, Chem. Commun. 51, 354 (2015). http://dx.doi.org/10.1039/c4cc07232d
• L. Rouger, B. Gouilleux, M. Pourchet-Gellez, J.-N. Dumez and P. Giraudeau, Ultrafast double-quantum NMR spectroscopy with optimized sensitivity for the analysis of mixtures, Analyst 141, 1686 (2015) http://dx.doi.org/10.1039/c6an00089d
• L. Guduff, A.J. Allami, C. van Heijenoort, J.-N. Dumez and I. Kuprov, Efficient simulation of ultrafast magnetic resonance experiments, Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 17577 (2017). http://dx.doi.org/10.1039/C7CP03074F
• B. Gouilleux, L. Rouger, B. Charrier, I. Kuprov, S. Akoka, J.-N. Dumez and P. Giraudeau, Understanding J-modulation during spatial encoding for sensitivity-optimized ultrafast NMR, ChemPhysChem, 16, 3093 (2015). http://dx.doi.org/10.1002/cphc.201500514

Les méthodes d’hyperpolarisation permettent une augmentation significative de la sensibilité en RMN. A travers des collaborations avec plusieurs laboratoires ayant mis en place des experiences d’hyperpolarisation, nous explorons le potentiel de cette approche pour l’analyse de mélanges. Le para-hydrogène permet une polarisation rapide et intense, qui s’applique à certaines classes de petites molécules. En collaboration avec Patrick Berthault et Gaspard Huber, au CEA Saclay, nous avons montré que des spectres 2D de mélanges à des concentrations inférieures au millimolaires peuvent être obtenues en un seul scan par RMN ultrarapide hyperpolarisée par le para-hydrogène. La polarisation dynamique nucléaire (DNP) est une méthode d’hyperpolaristion très générale. En collaboration avec Geoffrey Bodenhausen, Sami Jannin et Patrick Giraudeau, à l’EPFL, nous avons montré que des spectres 1D et 2D peuvent être obtenus très rapidement sur des extraits d’échantillons biologiques (cellules et fruits), grâce à la DNP. En travaillant avec D. Abergel, à l’ENS, nous avons montré que des données de RMN diffusionnelle peuvent être obtenues en une seule acquisition sur des échantillons hyperpolarisés par DNP.

Publications:

• L. Guduff, D. Kurzbach, C. van Heijenoort, D. Abergel and J.-N. Dumez, Single-scan 13C diffusion-ordered NMR spectroscopy of DNP-hyperpolarised substrates, Chem. Eur. J., in press. http://dx.doi.org/10.1002/chem.201703300
• J.-N. Dumez, J. Milani, B. Vuichoud, A. Bornet, J. Lalande-Martin, I. Tea, M. Yon, M. Maucourt, C. Deborde, A. Moing, L. Frydman, G. Bodenhausen, S. Jannin and P. Giraudeau, Hyperpolarized NMR of plant and cancer cell extracts at natural abundance, Analyst, 140, 5860 (2015). http://dx.doi.org/10.1039/c5an01203a
• V. Daniele, F.-X. Legrand, P. Berthault, J.-N. Dumez and G. Huber, Single-Scan Multidimensional NMR Analysis of Mixtures at Sub-Millimolar Concentrations by using SABRE Hyperpolarization, ChemPhysChem, in press. http://dx.doi.org/10.1002/cphc.201500535

La relaxation nucléaire longitudinale limite fortement l’information susceptible d’être obtenue par des expériences de résonance magnétique. Les états à longue durée de vie permettent de repousser cette limite et d’étendre la durée pendant laquelle une information peut être encodée en RMN, notamment pour les expériences d’hyperpolarisation. Nous explorons les propriétés des états à longue durée de vie dans les systèmes multi-spin, susceptibles d’étendre le champ d’application de ce concept et des méthodes d’hyperpolarisation. Nous avons notamment démontré que les états à longue durée de vie existent dans les groupes méthyles, et qu’ils peuvent être préparés par polarisation dynamique nucléaire.

Publications :

• S.S. Roy, J.-N. Dumez, G. Stevanato, B. Meier, J.T. Hill-Cousins, R.C.D. Brown, G. Pileio and M.H. Levitt, Enhancement of quantum rotor NMR signals by frequency-selective pulses, J. Magn Reson. 250, 25 (2015). http://dx.doi.org/10.1016/j.jmr.2014.11.004
• J.-N. Dumez, P. Hakansson, S. Mamone, B. Meier, G. Stevanato, J.T. Hill-Cousins, S.S. Roy R.C.D. Brown, G. Pileio and M.H. Levitt, Theory of long-lived nuclear spin states in methyl groups and quantum-rotor-induced polarization, J. Chem. Phys. 142, 044506 (2015). http://dx.doi.org/10.1063/1.4906273
• D. Mammoli, B. Vuichoud, A. Bornet, J. Milani J.-N. Dumez, S. Jannin and G. Bodenhausen, Hyperpolarized para-ethanol, J. Phys. Chem. B. 119, 4048 (2015). http://dx.doi.org/10.1021/jp512128c
• S. Elliott, L.J. Brown, J.-N. Dumez, M.H. Levitt, Long-lived nuclear spin states in monodeuterated methyl groups, Phys. Chem. Chem. Phys., 18, 17965 (2016). http://dx.doi.org/10.1039/c6cp03619h
• J.-N. Dumez, B. Vuichoud, D. Mammoli, A. Bornet, A.C. Pinon, G. Stevanato, B. Meier, G. Bodenhausen, S. Jannin and M.H. Levitt, Dynamic nuclear polarisation of long-lived nuclear spin states in methyl groups, J. Phys. Chem. Lett., 8, 3549 (2017). http://dx.doi.org/10.1021/acs.jpclett.7b01512

L’étude des propriétés structurales et fonctionnelles des protéines par résonance magnétique nucléaire repose sur la possibilité de les marquer avec des isotopes stables. Il peut s’agir de les enrichir uniformément en azote 15N, carbone 13C et parfois hydrogène 2H, lorsqu’elles sont de taille modérée (quelques dizaines de kDa) ou d’introduire très précisément des groupements méthyle 1H,13C au sein de protéines complètement deutérées 2H,12C pour étudier des objets de très grosse taille (plusieurs centaines de kDa). Ces marquages sont simples et peu coûteux à réaliser lorsque les protéines peuvent être produites à partir de culture d’Escherichia coli. Malheureusement de nombreuses protéines eucaryotes, humaines en particulier, ne peuvent être obtenues de cette façon, qu’elles aient spécifiquement besoin de chaperonne pour être correctement repliées ou de modification post-traductionnelle pour être actives. Il est parfois possible de produire ces protéines à partir de levure, mais le plus souvent il faut faire appel à des cellules d’organismes supérieurs, les plus généralement utilisées étant des cellules d’insecte (S2 ou Sf9 en conjonction avec un baculovirus). Les cellules d’insecte sont des organismes hétérotrophes qui croissent sur des milieux complexes, les plus efficaces étant des milieux commerciaux de composition inconnue. De tels milieux, enrichis en 15N, 13C et éventuellement 2H, existent pour la RMN, mais leurs prix sont prohibitifs. Nous avons donc entrepris de développer une série de solutions de marquage robustes et bon marché à partir de milieux commerciaux déplétés en acides aminés et de lysats de levure pouvant être marqués à relativement faible coût.

Publications :

• Meola A, Deville C, Jeffers SA, Guardado-Calvo P, Vasiliauskaite I, Sizun C, Girard-Blanc C, Malosse C, van Heijenoort C, Chamot-Rooke J, Krey T, Guittet E, Pêtres S, Rey FA, Bontems F. Robust and low cost uniform 15N-labeling of proteins expressed in Drosophila S2 cells and Spodoptera frugiperda Sf9 cells for NMR applications. J Struct Biol. 2014 188(1):71-8.
• Deville C, Girard-Blanc C, Assrir N, Nhiri N, Jacquet E, Bontems F, Renault L, Petres S, van Heijenoort C. FEBS Lett. 2016 590(20):3690-3699.

DADIMODO est un programme d’affinage de modèles atomiques de protéines multi-domaines ou de complexes de protéines, à l’aide de données de diffusion des rayons X aux petits angles, combinées à des contraintes de distances et des contraintes d’orientation entre domaines mesurées par RMN. Alors que les structures des domaines sont maintenues rigides au cours du processus d’optimisation, l’utilisateur peut définir des régions flexibles. Des changements conformationnels, spécifiés par l’utilisateur et incrémentés au fur et à mesure, sont appliqués de manière cyclique dans une algorithme d’optimisation stochastique qui fait une recherche dans l’espace des conformations des protéines. La convergence de cet algorithme génétique est accélérée par une pression de sélection adaptative. La structure de l’algorithme garantit qu’un modèle atomique complet physiquement acceptable est disponible à chaque étape de l’optimisation. Une interface graphique a été créée pour plus de convivialité. Le logiciel, comprenant le code Python, une documentation, des exemples et des scripts additionnels, est mis à disposition par les auteurs sur demande.

Publications :

• Evrard G, Mareuil F, Bontems F, Sizun C, Perez J (2007)  » DADIMODO : a program for refining the structure of multidomain proteins and complexes against small-angle scattering data and NMR-derived restraints ». J. Appl. Crystallogr., 44(6):1264-1271.
• Macheboeuf P, Piuzzi M, Finet S, Bontems F, Pérez J, Dessen A, Vachette P (2011) « Solution X-ray scattering study of a full-length class A penicillin-binding protein ». Biochem Biophys Res Commun, 405(1):107-11.
• Mareuil F, Sizun C, Perez J, Schoenauer M, Lallemand JY, Bontems F (2007) « A simple genetic algorithm for the optimization of multidomain protein homology models driven by NMR residual dipolar coupling and small angle X-ray scattering data ». Eur Biophys J, 37 : 95-104.

NOENet est un logiciel qui permet d’obtenir l’attribution des résonances RMN du squelette peptidique en exploitant une structure 3D connue de la protéine. Comparé à la méthode standard d’attribution en RMN qui est basée sur les connectivités séquentielles de couplage-J impliquant les noyaux 13C, 15N et 1H, l’approche de l’attribution basée sur la structure de NOEnet utilise un jeu de données complètement indépendant, basé sur les connectivités spatiales NOE entre noyaux HN-HN. La comparaison du réseau NOE avec la structure 3D produit déjà des résultats d’attributions satisfaisantes, qui peuvent être améliorés en ajoutant des données de déplacement chimique (CS) et/ou de couplage dipolaires résiduels (RDC). En plus, la combinaison des deux données orthogonales – couplage-J et NOE – donne de très bons résultats pour l’attribution. Pour cela, l’approche de l’attribution basée sur la structure de NOEnet est une alternative prometteuse à l’approche standard de l’attribution en RMN et en même temps un complément très utile de l’approche standard.

Publications :

• Stratmann D, Guittet E, van Heijenoort C. Robust structure-based resonance assignment for functional protein studies by NMR. J Biomol NMR 2010 Feb ;46(2):157-73
• Stratmann D, van Heijenoort C, Guittet E. NOEnet—use of NOE networks for NMR resonance assignment of proteins with known 3D structure. Bioinformatics 2009 25(4):474-481

L’attribution des résonances du squelette peptidique prend plusieurs jours au minimum en général, ceci malgré l’apparition de nouvelles méthodes de collecte de données et de logiciels permettant l’analyse automatique des données. L’attribution se fait sur la base de la séquence en acides aminés de la protéine, les connectivités séquentielles entre paires H-N et le type d’acide aminé associé à chaque paires. Nous nous sommes intéressés à développer une série d’outils permettant dans le meilleur des cas, d’obtenir l’attribution en quelques heures :

• Le principe BEST (Schanda, Van Melckebeke & Brutscher JACS2006/ Lescop, Schanda & Brutscher, JMR 2007) réduit la durée nécessaire au retour à l’équilibre de l’aimantation, ce qui permet de réduire le délai entre deux répétitions de la séquence d’impulsions : les expériences triple résonances H-N-C peuvent être collectées en quelques dizaines de minutes (au lieu de quelques heures). Nous avons récemment amélioré notre compréhension des phénomènes de couplages durant les impulsions rendant plus facile l’optimisation des séquences BEST.
• La méthode de compression spectrale ASCOM (Lescop E, Schanda P, Rasia R & Brutscher, B, JACS 2007) permet de réduire de façon significative (d’un facteur 1,5 à 3) le nombre de répétitions de la séquence d’impulsions sans perte d’informations. Elle est basée sur l’optimisation du repliement spectral (aliasing).
• La technique COBRA (Lescop, E., & Brutscher, B. JACS 2007) extrait automatiquement l’information de connectivité séquentielle entre deux H-N à partir des paires d’expériences triple résonances. Elle est basée sur le calcul de coefficient de corrélation entre deux fonctions temporelles.
• La nouvelle expérience HADAMAC (Lescop, E., Rasia, R., & Brutscher, B. JACS 2008) donne une information très discriminante pour identifier le type d’acide aminé associé à chaque H-N

Afin d’optimiser l’attribution, nous avons développé le logiciel BATCH qui facilite grandement le traitement des spectres, la détection des signaux, l’attribution automatique et l’extraction des déplacements chimiques. Dans le cas d’une protéine de moins de 100 acides aminés à concentration mM, l’ensemble de l’étape d’attribution peut maintenant être effectué en quelques heures.

Nous continuons à améliorer les différentes séquences d’impulsions et à les rendre facilement accessibles à la communauté par le biais des logiciels des constructeurs.

Publications :

• Brutscher B, Lescop E. « Fast protein backbone NMR resonance assignment using the BATCH strategy. » Methods Mol Biol. (2012), 831:407-28.
• Lescop E, Kern T, Brutscher B. « Guidelines for the use of band-selective radiofrequency pulses in hetero-nuclear NMR : example of longitudinal-relaxation-enhanced BEST-type 1H-15N correlation experiments. » J Magn Reson. (2010) 203, 190-8
• BATCH : Lescop E, & Brutscher B, « Highly automated protein backbone resonance assignment within a few hours : the BATCH strategy and software package” (2009) J. Biomol. NMR, 44(1):43-57