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Introduction

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une technique puissante pour l’analyse d’objets biologiques à l‘échelle atomique. Tout d’abord, elle fournit des informations sur la structure tridimensionnelle des molécules, en menant des expériences indiquant l’organisation spatiale relative des atomes. Au-delà de la structure, la RMN est une méthode unique pour la caractérisation de la dynamique à la fois globale et locale des molécules sur des gammes de temps allant de la picoseconde à plusieurs mois. Les systèmes biologiques font intervenir des réseaux d’interaction complexes impliquant macromolécules et petites molécules. Le défi lancé par la biologie structurale est de caractériser et de comprendre les mécanismes de reconnaissance moléculaires à l’échelle de d’atome. La RMN est particulièrement utile pour l’identification des sites de contacts intermoléculaires, pour l’analyse des propriétés dynamiques des macromolécules et des interfaces, pour la compréhension du rôle du solvant, pour l’étude du repliement des macromolécules, et pour l’étude systématique des interactions entre récepteurs et des cibles thérapeutiques potentielles.

Dans ce contexte particulièrement excitant, notre laboratoire est impliqué dans l’analyse structurale et dynamique de systèmes biologiques dans lesquels la question de l’interaction avec un partenaire et/ou la dynamique du système est pertinente.

Caractérisation par RMN de la métallo-b-lactamase NDM-1 et étude de son interaction avec les flavonoïdes

NDM-1 est une métallo-b-lactamase  produite par des souches de bactéries à Gram négatif comme Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa. Le gène qui code pour NDM-1, appelé blaNDM-1, a été identifié dans des chromosomes bactériens et des plasmides transmissibles. NDM-1 est récemment apparu comme une menace mondiale en raison de sa capacité à conférer une résistance à tous les antibiotiques b-lactames courants et de sa présence dans les infections nosocomiales. À ce stade, le NDM-1 est détecté sur presque tous les continents. Nous avons étudié NDM-1 par RMN en présence et en absence de Zn (II). Les paramètres de relaxation issus des données RMN en présence et en absence zinc montrent que la liaison de Zn(II) dans le site actif de NDM-1 induit plusieurs changements structurels et dynamiques sur les boucles ASL2, ASL3 et ASL5. À partir d’analyses enzymatiques, trois flavonols: la morine, la quercétine et la myricétine ont été identifiés comme inhibiteurs naturels et spécifiques de NDM-1, avec une affinité de l’ordre du micro molaire. Pour caractériser ces complexes, des expériences RMN sur NDM-1 en présence de ces flavonols ont été effectuées et les résultats montrent que les résidus des boucles ASL-1, ASL2 et ASL-4 sont impliqués dans la liaison des flavonoïdes. Nos résultats fournissent un support pour les modèles d’interactions NDM-1/flavonols, qui pourront être utiles pour la conception rationnelle d’inhibiteurs contre NDM-1.

Publications:

  • Morellet N, Li X, Wieninger SA, Taylor JL, Bischerour J, Moriau S, Lescop E, Bardiaux B, Mathy N, Assrir N, Bétermier M, Nilges M, Hickman AB, Dyda F, Craig NL, Guittet E. Nucleic Acids Res. 2018 Mar 16 ;46(5):2660-2677, http://dx.doi.org/10.1093/nar/gky044

Analyse structurale des mécanismes d’activation de la partie C-terminale du récepteur de la tyrosine kinase ErbB2.

Contexte – Les récepteurs tyrosine kinase jouent un rôle essentiel dans la transduction de signaux extracellulaires en signaux intracellulaires, permettant à la cellule de s’adapter à son environnement. Il n’est pas surprenant que la surexpression de cette classe de protéines conduise à des dérèglements physiologiques majeurs, en particuliers des tumeurs malignes. ErbB2 est surexprimé dans environ 25% des cancers du sein. Cette surexpression entraine l’activation constitutive de voies de signalisation associées à son activité tyrosine kinase pouvant induire plusieurs caractéristiques des cellules cancéreuses dont la prolifération, la résistance à l’apoptose et l’augmentation de la mobilité cellulaire. Les études réalisées jusqu’à présent se sont concentrées sur les domaines extracellulaires et transmembranaires et ont conduit à une thérapie efficace contre le cancer du sein. Cependant, seuls 30% des tumeurs liées à ErbB2 répondent au traitement (trastuzumab) et deviennent de plus résistantes au traitement dans les trois ans qui suivent son début.

Notre objectif est de décrire et comprendre le fonctionnement de l’édifice supramoléculaire associé au domaine C-terminal intrinsèquement désordonné d’ErbB2 (CtErbB2, 276aa), dont les phosphorylations conduisent à l’interaction avec plusieurs protéines effectrices et l’activation de multiples processus cellulaires. Les challenges de ce projet sont d’une part, l’étude d’interactions multiples avec un domaine intrinsèquement désordonné de grande taille (276aa) riche en prolines et conditionnées par plusieurs phosphorylations, d’autre part, l’intégration des résultats structuraux dans un contexte cellulaire (projet en partenariat avec Ali Badache, Centre de Cancérologie de Marseille) et thérapeutique (projet en partenariat avec Françoise Guerlesquin, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, Marseille).

Références :

  1. A. Badache & A. Gonçalves, J. Mammary Gland Biol Neoplasia (2006) The ErbB2 Signaling Network as a Target for Breast Cancer Therapy
  2. O. Bornet et al., FEBS Letters 2014

Publications:

  • YingHui Wang, Louise Pinet, Nadine Assrir, Latifa Elantak, Françoise Guerlesquin, Ali Badache, Ewen Lescop and Carine van Heijenoort (2017). 1H, 13C and 15N assignments of the C-terminal intrinsically disordered cytosolic fragment of the receptor tyrosine kinase ErbB2, Biomol NMR Assign., https://doi.org/10.1007/s12104-017-9773-4

Caractérisation structurale et dynamique des interactions de la proline cis-trans isomérase FKBP7, nouvelle cible dans le cancer de la prostate résistant aux traitements.

La chimiothérapie à base de taxanes est le traitement standard du cancer de la prostate métastatique résistant à la castration (mCRPC) au stade avancé. Cependant, des mécanismes de résistance émergent et le mCRPC devenu résistant au docetaxel représente l’un des plus grands défis cliniques dans la gestion de cette maladie. Il est donc fondamental de trouver de nouvelles stratégies pour vaincre la résistance aux taxanes et améliorer encore la survie.
Un mécanisme original a été identifié récemment par notre collaboratrice A. Chauchereau à l’Institut Gustave Roussy dans lequel la protéine FKBP7 régule l’activité du complexe d’initiation de la traduction eIF4F, et plus précisément eIF4G, suggérant que FKBP7 est une cible thérapeutique prometteuse. Changer le mécanisme d’initiation de la traduction reprogramme en effet de manière dynamique les types d’ARNm qui sont traduits dans la cellule en réponse au stress ou à la résistance aux médicaments. Les protéines FKBPs, y compris FKBP7, sont dotées d’une activité Peptidyl-Prolyl isomerase (PPIase) qui accélère l’isomérisation cis-trans des liaisons peptidiques des acides aminés proline. En modifiant la conformation des protéines cibles, comme eIF4G par exemple, les FKBPs affectent la signalisation intracellulaire et jouent un rôle important dans de nombreuses maladies et notamment dans le cancer.
Dans ce projet, nous caractérisons la protéine FKBP7, membre très peu étudié de la famille des FKBPs du réticulum endoplasmique et donc impliquée dans le cancer chimio-résistant. Nous étudions la structure et la dynamique de la protéine dans différents états redox, en présence ou non de calcium, et en interaction avec des partenaires peptidiques ou de petites molécules inhibitrices, dans l’objectif de poser les bases rationnelles de recherche d’inhibiteurs de cette enzyme. Nous utilisons un panel de techniques, dont essentiellement la biochimie et la RMN, mais également la diffraction et la diffusion des RX, le TSA, le MST, l’ITC, et la modélisation moléculaire et les tests cellulaires avec notre collaboratrice.

Références :

  1. Garrido MF, Martin NJ, Bertrand M, Gaudin C, Commo F, El Kalaany N, Al Nakouzi N, Fazli L, Del Nery E, Camonis J, Perez F, Lerondel S, Le Pape A, Compagno D, Gleave M, Loriot Y, Désaubry L, Vagner S, Fizazi K, Chauchereau A. Clin Cancer Res. 2019 Jan 15;25(2):710-723. doi: 10.1158/1078-0432

Étude des bases moléculaires de la réversion tumorale : exploration du réseau d’interactions de la protéine TCTP

Le cancer est un problème de santé publique majeur dans les pays développés. Son étude s’est longtemps focalisée sur le processus de tumorigénèse avec la caractérisation d’oncogènes et de suppresseurs de tumeurs. Dans les années 1960, le processus de réversion tumorale a pour la première fois été mis en évidence[1]. Il a été montré que des cellules cancéreuses peuvent spontanément perdre leur phénotype malin sans pour autant retrouver les caractéristiques génotypiques des cellules saines. Loin de constituer un retour en arrière, la réversion tumorale est donc un processus postérieur à la tumorigénèse, il peut s’agir de l’étape d’après[2]. Quelques acteurs protéiques clés ont été identifiés dans ce processus. Parmi ceux-ci TCTP, petite protéine soluble d’environ 20kDa comportant une région intrinsèquement désordonnée, a été décrite comme pouvant jouer le rôle d’interrupteur de la réversion tumorale. Il a été montré que son extinction par RNA silencing dans certains types de cellules cancéreuses peut suffire à abolir le phénotype malin des cellules considerées[3]. En conséquence, TCTP est une cible pharmacologique d’intérêt et des stratégies la ciblant sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Le rôle de TCTP dans la réversion tumorale fait notamment intervenir son rôle régulateur de nombreuses autres protéines et nous avons récemment publié une revue décrivant l’interactome de TCTP. Nous cherchons à comprendre finement les mécanismes d’activation avec un intérêt particulier pour les changements structuraux ayant lieu durant la formation de ces complexes protéiques, en combinant différentes méthodes biophysiques (RMN, CD, SAXS, DLS, MST…). Nous avons commencé par caractériser la dynamique de la longue boucle interne dans un article récent publié dans le Journal of Molecular Biology. Ce travail permettra d’enrichir notre compréhension de la réversion tumorale, de la biologie de TCTP ainsi que des développements thérapeutiques en cours.

Références :

  1. Pollack RE et al. PNAS (1968)
  2. Telerman A, Amson, R. Nat. Rev. Cancer (2009)
  3. Gnanasekar M. Int J Oncol. (2009)

Publications:

  • Malard F, Assrir N, Alami M, Messaoudi S, Lescop E, Ha-Duong T.  Conformational Ensemble and Biological Role of the TCTP Intrinsically Disordered Region : Influence of Calcium and Phosphorylation. J. Mol. Biol. 430, 1621–1639 2018
  • Assrir N, Malard F, Lescop E. Structural Insights into TCTP and Its Interactions with Ligands and Proteins. Results Probl Cell Differ. 2017 ;64:9-46.
  • Malard F, Sizun C, Thureau A, Carlier L, Lescop E. Structural transitions in TCTP tumor protein upon binding to the anti-apoptotic protein family member Mcl-1. J Biol Chem. 2023 May 16:104830.
  • Malard F, Jacquet E, Nhiri N, Sizun C, Chabrier A, Messaoudi S, Dejeu J, Betzi S, Zhang X, Thureau A, Lescop E. Revisiting the Molecular Interactions between the Tumor Protein TCTP and the Drugs Sertraline/Thioridazine. ChemMedChem. 2022 17(1):e202100528.
  • Malard F, Sizun C, Thureau A, Carlier L, Lescop E. Structural transitions in TCTP tumor protein upon binding to the anti-apoptotic protein family member Mcl-1. J Biol Chem. 2023 104830

Étude de l’interaction entre la mycolactone, produite par Mycobacterium ulcerans, et la protéine WASp, qui serait responsable de l’apparition de l’Ulcère de Buruli.

L’ulcère de Buruli est causé par une mycobactérie, Mycobacterium ulcerans, qui provoque des ulcérations cutanées extrêmement profondes, détruit la peau, les tissus sous-cutanés, les muscles, et peut même attaquer l’os. Mycobacterium ulcerans, transmise par un insecte, serait la seule mycobactérie capable de produire une toxine, la mycolactone. L’équipe de Caroline Démangel à Pasteur a montré que la mycolactone perturbe la capacité d’adhésion et de migration des cellules, ce qui indique une interférence possible avec la voie de transmission du signal de la GTPase, Cdc42/Rac. L’implication des protéines de la famille protéique du Syndrome de Wiskott Aldrich (WASp et N-WASp) a été envisagée, car elles s’associent à Cdc42 par le biais de leurs domaines de liaison à Cdc42/Rac (CRIB), afin de réguler la formation des filaments d’actine. L’équipe de Caroline Démangel a montré que la mycolactone est capable de se lier significativement et avec une forte affinité au domaine CRIB de N-WASp, perturbant ainsi son activité de polymérisation de l’actine. Notre but est de déterminer la structure du complexe formé par le domaine CRIB de Wasp et la mycolactone afin de comprendre le mode d’interaction de cette toxine.

Étude structure/fonction de domaine riche en cystéines de transposases piggyBac domestiquées chez la paramécie.

Les éléments génétiques mobiles (séquences ADN ayant la capacité de se déplacer dans le génôme), et plus particulièrement les transposons, codent pour les enzymes qui assurent leur transfert d’un locus à un autre dans le génôme (transposases, intégrases…). Les transposons participent aussi à l’évolution des génomes en permettant l’apparition de nouveaux gènes dérivés d’éléments transposables, mais inactifs en terme de mobilité. Cette domestication moléculaire peut conduire à l’émergence de nouvelles fonctions cellulaires. Cependant, la fonction de la plupart des transposases domestiquées (46 identifiées dans le génome humain) demeure encore inconnue. Le cas de la protéine PiggyMac de Paramecium tetraurelia est exceptionnel. Il s’agit en effet de l’un des rares exemples de transposase domestiquée pour laquelle une fonction biologique a été identifiée. De plus, les propriétés catalytiques d’une transposase PiggyBac canonique ont été étudiées in vitro, ce qui fait de Paramecium tetraurelia un modèle unique pour l’étude des éléments moléculaires de la domestication, grâce à la comparaison d’une transposase et de sa forme domestiquée. Notre but est de déterminer les structures de différents domaines présents chez PiggyBac et PiggyMac afin d’évaluer leur évolution entre la transposase et la transposase domestiquée.

Publications :

  • Morellet N, Li X, Wieninger SA, Taylor JL, Bischerour J, Moriau S, Lescop E, Bardiaux B, Mathy N, Assrir N, Bétermier M, Nilges M, Hickman AB, Dyda F, Craig NL, Guittet E. Nucleic Acids Res. 2018 Mar 16 ;46(5):2660-2677.
  • Guérineau M, Bessa L, Moriau S, Lescop E, Bontems F, Mathy N, Guittet E, Bischerour J, Bétermier M, Morellet N. Mob DNA. The unusual structure of the PiggyMac cysteine-rich domain reveals zinc finger diversity in PiggyBac-related transposases.  2021 Apr 29;12(1):12. doi: 10.1186/s13100-021-00240-4.

Études structurales et dynamiques de microcines.

Les peptides lasso sont des peptides bioactifs produits par des bactéries qui montrent une structure compacte originale contenant un cycle en N-terminale formée par une liaison lactame entre le résidu N-terminal et la chaîne latérale d’un acide aminé acide (Asp ou Glu) en position 8 ou 9, et où la queue C-terminale s’enfile de manière irréversible (voir figure). Dans un effort collaboratif impliquant ingénierie génétique, spectrométrie de masse et RMN, nous visons à mieux comprendre la manière dont ce peptide se structure pour former un repliement aussi extraordinaire, et à caractériser des mutants en terme d’activité antibactérienne. Le but à long terme de cette étude est de fournir une plateforme de développement d’antibiotiques originaux.

Publications :

  • Ducasse R, Yan KP, Goulard C, Blond A, Li Y, Lescop E, Guittet E, Rebuffat S and Zirah S. (2012) Chembiochem. ; 13(3):371-80
  • Li Y, Ducasse R, Zirah S, Blond A, Goulard C, Lescop E, Giraud C, Hartke A, Guittet E, Pernodet JL, Rebuffat S. (2015) ACS Chem Biol. 10(11):2641-9.
  • Assrir N, Pavelkova A, Dazzoni R, Ducasse R, Morellet N, Guittet E, Rebuffat S, Zirah S, Li Y, Lescop E. (2016) Chembiochem.17(19):1851-1858.
  • Romano M, Fusco G, Choudhury HG, Mehmood S, Robinson CV, Zirah S, Hegemann JD, Lescop E, Marahiel MA, Rebuffat S, De Simone A, Beis K. ACS Chem Biol. (2018) Jun 15 ;13(6):1598-1609.
  • Jeanne Dit Fouque K, Hegemann JD, Zirah S, Rebuffat S, Lescop E, Fernandez-Lima F. J Am Soc Mass Spectrom. (2019) 30(6):1038-1045. doi: 10.1007/s13361-019-02134-5.

Étude structurale de la protéine de capside du virus d’immunodéficience félin (FIV).

Au moment de sa sortie de la cellule, la capside des rétrovirus est formée d’environ deux mille cinq cent copies de la polyprotéine Gag, associées dans un réseau d’hexamères. L’ancrage de la protéine à la membrane du virus se fait par l’intermédiaire du domaine de matrice, l’association avec le génome se fait par le domaine de nucléocapside et les interactions entre les protéines Gag par le domaine de capside et le peptide qui le suit, dit peptide Sp1 (spacer 1). Une fois le virus sorti de la cellule, la protéine Gag est clivée, chaque domaine devenant une protéine indépendante. Les protéines de matrice et de nucléocapside restent associées à la membrane et à l’ARN. Un premier fragment contenant la protéine de capside et le peptide Sp1 est formé, conduisant à la dissociation de la capside immature. Le clivage subséquent entre la protéine de capside et le peptide Sp1 entraine la formation de la capside mature.

Nous nous intéressons aux propriétés du fragments protéine de capside – peptide Sp1 pour comprendre le rôle du peptide Sp1 dans le passage de la capside immature à la capside mature. Nous nous intéressons aussi aux propriétés de dimérisation du domaine C-terminal de la protéine de capside, impliqué dans les contacts entre les hexamères de Gag (capside immature) et les héxamères et pentamère de protéine de capside (capside mature). Finalement, nous cherchons à comprendre l’éventuel rôle de deux cystéines conservées situées dans le domaine C-terminal et pouvant potentiellement évoluer d’un état réduit à un état oxydé (pont disulfure) au moment de la maturation de la capside.

Étude de la structure et des interactions des protéines du complexe polymérase du virus respiratoire syncytial humain.

Au moment de sa sortie de la cellule, la capside des rétrovirus est formée d’environ deux mille cinq cent copies de la polyprotéine Gag, associées dans un réseau d’hexamères. L’ancrage de la protéine à la membrane du virus se fait par l’intermédiaire du domaine de matrice, l’association avec le génome se fait par le domaine de nucléocapside et les interactions entre les protéines Gag par le domaine de capside et le peptide qui le suit, dit peptide Sp1 (spacer 1). Une fois le virus sorti de la cellule, la protéine Gag est clivée, chaque domaine devenant une protéine indépendante. Les protéines de matrice et de nucléocapside restent associées à la membrane et à l’ARN. Un premier fragment contenant la protéine de capside et le peptide Sp1 est formé, conduisant à la dissociation de la capside immature. Le clivage subséquent entre la protéine de capside et le peptide Sp1 entraine la formation de la capside mature.

Le virus respiratoire syncytial humain (VRS) est un pathogène responsable de bronchiolites et de pneumonies chez les jeunes enfants et les nouveau-nés et l’une des principales causes d’hospitalisation pour des infections virales à cet âge. La forme bovine du VRS représente un problème économique important en raison de la morbidité et de la mortalité accrue dans les élevages de veaux infectés. Actuellement il n’existe pas de vaccin pour la forme humaine ni de d’inhibiteurs spécifiques. Notre approche, en collaboration avec les équipes de J.-F. Eléouët à I’NRA de Jouy-en-Josas et de F. Rey à l’Institut Pasteur, consiste à caractériser la structure atomique et les propriétés d’interaction de cibles virales spécifiques pour assister la recherche de molécules virales. Le VRS étant un virus enveloppé à ARN non segmenté de polarité négative, de la famille des Paramyxoviridae, le complexe viral ARN polymérase ARN dépendant (RdRp), qui n’a pas d’équivalent cellulaire, constitue une cible prometteuse. Dans notre groupe nous utilisons la RMN comme outil pour :

  • déterminer la structure de petites protéines virales ou de domaines (<25 kDa),
  • identifier des surfaces d’interaction entre protéines virales ou avec des partenaires cellulaires, en particulier dans le cas de faibles affinités,
  • explorer la dynamique et les structures transitoires de protéines avec de larges régions désordonnées.

Combinés aux données structurales obtenues à l’Institut Pasteur par cristallographie, ces résultats sont validés par génétique inverse à l’INRA. Nous nous intéressons plus particulièrement :

  • au co-facteur M2-1 du VRS qui évite une terminaison prématurée de la transcription par le RdRp du VRS,
  • aux modes d’association de la nucléoprotéine (N) avec la phosphoprotéine (P) du VRS.

Le rôle de l’interaction M2-1:P pour le recrutement de M2-1 aux centres de réplication du virus a été mis en évidence par des expériences de co-localisation et à l’aide d’un minigénome, sur la base de la structure RMN du domaine globulaire de M2-1 et des données d’interaction avec des ARN et P, obtenues par RMN. Pour caractériser le complexe N:P, qui est central pour la fonction de la polymérase, notre démarche consiste à identifier des domaines fonctionnels étudiés isolément et en combinaison avec différents partenaires. P étant requise à la fois pour permettre à la polymérase d’accéder à l’ARN viral génomique encapsidé et à maintenir N dans une forme sans ARN, N°:P, nous étudions les changements conformationnels de P associés.

Publications :

  • Khodjoyan S, Morissette D, Hontonnou F, Checa Ruano L, Richard CA, Sperandio O, Eléouët JF, Galloux M, Durand P, Deville-Foillard S, Sizun C. Int J Mol Sci. 2022 Dec 29;24(1):569. doi: 10.3390/ijms24010569.
  • Dong J, Basse V, Bierre M, Peres de Oliveira A, Vidalain PO, Sibille P, Tangy F, Galloux M, Eleouet JF, Sizun C, Bajorek M. J Mol Biol. 2022 Oct 15;434(19):167763. doi: 10.1016/j.jmb.2022.167763. Epub 2022 Jul 28.
  • Decool H, Gonnin L, Gutsche I, Sizun C, Eléouët JF, Galloux M. Viruses. 2021 Dec 6;13(12):2449. doi: 10.3390/v13122449.
  • Cardone C, Caseau CM, Bardiaux B, Thureaux A, Galloux M, Bajorek M, Eléouët JF, Litaudon M, Bontems F, Sizun C. Biomolecules. 2021 Aug 17;11(8):1225. doi: 10.3390/biom11081225.
  • Bajorek M, Galloux M, Richard CA, Szekely O, Rosenzweig R, Sizun C, Eleouet JF. J Virol. 2021 Mar 10;95(7):e02217-20. doi: 10.1128/JVI.02217-20.
  • Cardone C, Caseau CM, Pereira N, Sizun C. Int J Mol Sci. 2021 Feb 3;22(4):1537.
  • Richard CA, Rincheval V, Lassoued S, Fix J, Cardone C, Esneau C, Nekhai S, Galloux M, Rameix-Welti MA, Sizun C, Eléouët JF. (2018) PLoS Pathog.14(3):e1006920.
  • Pereira N, Cardone C, Lassoued S, Galloux M, Fix J, Assrir N, Lescop E, Bontems F, Eléouët JF, Sizun C. J Biol Chem. 2017 Feb 10 ;292(6):2120-2131. doi : 10.1074/jbc.M116.765958.
  • Ouizougun-Oubari M, Pereira N, Tarus B, Galloux M, Lassoued S, Fix J, Tortorici MA, Hoos S, Baron B, England P, Desmaële D, Couvreur P, Bontems F, Rey FA, Eléouët JF, Sizun C, Slama-Schwok A, Duquerroy S. (2015) J Virol. ;89(21):11129-43.
  • Blondot ML, Dubosclard V, Fix J, Lassoued S, Aumont-Nicaise M, Bontems F, Eleouet JF, Sizun C (2012) Structure and functional analysis of the RNA- and viral phosphoprotein-binding domain of respiratory syncytial virus M2-1 protein. PLoS Pathog 8(5):e1002734.
  • Dubosclard V, Blondot ML, Eleouet JF, Bontems F, Sizun C (2011) 1H, 13C, and 15N resonance assignment of the central domain of hRSV transcription antitermination factor M2-1. Biomolecular NMR Assignments 5 : 237-239.

RegB/S1 : un système modèle de couplage entre le démarrage de la traduction et la dégradation des ARN messagers chez E. coli

Le niveau d’expression d’un gène dépend de l’efficacité de la transcription de son ARN messager, mais aussi du nombre de copies de ce dernier, lui-même fonction des vitesses relatives de synthèse et de dégradation. L’analyse de l’expression génique doit donc prendre en compte ces trois phénomènes simultanément, mais aussi la possibilité de couplage entre eux. Nous étudions un système modèle de couplage entre la traduction et la dégradation d’ARN messagers bactériens, composé de la ribonucléase RegB du bactériophage T4 et de la protéine ribosomale S1, spécifique des organismes procaryotes. Le rôle premier de S1 est d’aider le ribosome à reconnaître la région de démarrage de la traduction sur un ARN messager lorsque la région Shine-Dalgarno (consensus AGGAGG) est absente ou dégénérée. Plusieurs bactériophages (T4, Qβ) détournent l’activité de S1 et l’utilisent pour leur propre machinerie de réplication. RegB clive de manière préférentielles des séquences d’acides nucléiques contenant précisément le motif GGAG, y compris son propre messager, et participe ainsi au contrôle du cycle de vie du bactériophage T4 en inactivant spécifiquement les messagers en fin de phase précoce. L’efficacité de cette ribonucléase est modulée par la protéine S1. Alors que de nombreuses fonctions ont été décrites pour S1, son mécanisme d’action n’est toujours pas connu, même si une activité hélicase a été montrée. Nous avons déterminé la structure de RegB par RMN et montré qu’elle appartient à une famille de ribonucléases impliquées dans l’inactivation des ARN messagers en cours de traduction, mobilisées par les bactéries lorsque des changements de métabolisme rapides sont requis. Les régions d’interaction avec ses substrats ont été déterminées par cartographie des déplacements chimiques et le rôle de résidus impliqués dans la liaison aux ARN et au clivage analysé par mutagenèse aléatoire et dirigée. Parmi les six domaines « S1 » homologues de la protéine S1 nous avons identifié une région de liaison aux ARN responsable de l’activation de RegB (domaines 3, 4 et 5 = fragment F35) et nécessaires au démarrage de la traduction ainsi que pour la réplication du génome de certains phages à ARN. Nous avons déterminé la structure des domaines 4 et 6 isolés par RMN et caractérisé l’arrangement des domaines dans F35 par RMN et SAXS. Nous avons également décrit la liaison de l’ARN et les réarrangements structuraux de ces trois domaines en présence d’ARN. Nous nous intéressons actuellement au modes de liaison de la région N-terminale de S1 au ribosome d’E. coli.

Publications :

  • Giraud P, Créchet JB, Uzan M, Bontems F, Sizun C. Resonance assignment of the ribosome binding domain of E. coli ribosomal protein S1. (2015) Biomol NMR Assign. 9(1):107-11.
  • Evrard G, Mareuil F, Bontems F, Sizun C, Perez J (2011)  » DADIMODO : a program for refining the structure of multidomain proteins and complexes against small-angle scattering data and NMR-derived restraints ». J. Appl. Crystallogr., 44(6):1264-1271.
  • Salah P, Bisaglia M, Aliprandi P, Uzan M, Sizun C, Bontems F (2009) Probing the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis. Nucleic Acids Res 37 : 5578-88.
  • Aliprandi P, Sizun C, Perez J, Mareuil F, Caputo S, Leroy JL, Odaert B, Laalami S, Uzan M, Bontems F (2008) S1 ribosomal protein functions in translation initiation and ribonuclease RegB activation are mediated by similar RNA-protein interactions : an NMR and SAXS analysis. J Biol Chem 283 : 13289-301.
  • Odaert B, Saida F, Aliprandi P, Durand S, Crechet JB, Guerois R, Laalami S, Uzan M, Bontems F (2007) Structural and functional studies of RegB, a new member of a family of sequence-specific ribonucleases involved in mRNA inactivation on the ribosome. J Biol Chem 282 : 2019-28.
  • Saida F, Uzan M, Odaert B, Bontems F (2006) Expression of highly toxic genes in E. coli : special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci 7 : 47-56.
  • Durand S, Richard G, Bisaglia M, Laalami S, Bontems F, Uzan M (2006) Activation of RegB endoribonuclease by S1 ribosomal protein requires an 11 nt conserved sequence. Nucleic Acids Res 34 : 6549-60.

Le rôle de la protéine MitoNEET dans le trafic de centre Fe-S dans la mitochondrie.

MitoNEET est une petite protéine mitochondriale à centre Fe-S dont la fonction cellulaire exacte est encore inconnue. Identifiée à l’origine comme étant un ligand de la pioglitazone, un antidiabétique utilisé cliniquement (mais retirée récemment pour ses effets secondaires), MitoNEET semble être une cible intéressante comme antidiabétique, mais aussi dans d’autres pathologies (cancer). La structure cristallographique de MitoNEET est connue et est constituée d’un dimère de deux fois 108 acides aminés, dont les 40 premiers acides aminés sont destructurés. L’équipe de Cécile Bouton (ICSN) a initié un projet sur l’étude de mitoNEET d’un point de vue fonctionnel dans la cellule, plus précisément au niveau des transferts de centre Fe-S à travers la mitochondrie. Nous collaborons avec l’équipe de C. bouton depuis 2010 pour compléter la compréhension de MitoNEET par des aspects biophysiques.

Nous avons ainsi montré qu’à pH acide, la perte du centre Fe-S mène à la déstructuration de la protéine, et que l’étape limitante est la perte du centre Fe-S. Sous sa forme apo, les extrémités N- et C-terminales de la protéine sont complètement flexibles alors que le cœur de la séquence est invisible en RMN. Ceci est compatible avec une étude qui a indiqué qu’en absence de Fe/S, MitoNEET est dégradé dans la cellule par la voie protéasomale de la même manière qu’une protéine déstructurée. Nous avons aussi mis en évidence qu’à bas pH, MitoNEET est capable de donner spontanément son centre Fe-S à la ferredoxine, un accepteur non naturel de centre Fe-S. Combinées à des données cellulaires, nous avons proposé que MitoNEET puisse agir en tant que protéine réparatrice de protéines cytosoliques à centre Fe-S, telles que IRP1, en conditions de stress oxydant.

Plus récemment, dans le contexte de l’ANR Midiazone (2013-2016), nous avons montré que l’état rédox du centre Fe-S de MitoNEET affectait considérablement la stabilité de la protéine : dans son état réduit, MitoNEET ne perd plus son centre Fe-S à bas pH, ni ne le transfère à d’autres protéines. Nous avons aussi montré que seul l’état redox, et non l’oxygène, affecte la vitesse de transfert, et que l’effet pH sur la stabilité du centre Fe-S n’était visible que pour l’état oxydé. Tout ceci nous a amené à proposer que MitoNEET est une protéine de type « senseur redox » : en normoxie, la protéine est dans un état dormant (réduit) tandis que suite à un stress oxydant, elle va s’oxyder et transférer plus facilement son centre Fe-S à des partenaires cytosoliques pour leur rendre leur centre Fe-S.

Publications :

  • Mons C, Botzanowski T, Nikolaev A, Hellwig P, Cianférani S, Lescop E, Bouton C, Golinelli-Cohen MP. Biochemistry. (2018) 57(38):5616-5628.
  • Mons C, Ferecatu I, Riquier S, Lescop E, Bouton C, Golinelli-Cohen MP. (2017) Methods Enzymol.;595:83-106.
  • Golinelli-Cohen MP, Lescop E, Mons C, Gonçalves S, Clémancey M, Santolini J, Guittet E, Blondin G, Latour JM, Bouton C. (2016) J Biol Chem. Apr 1 ;291(14):7583-93.
  • Ferecatu I, Gonçalves S, Golinelli-Cohen MP, Clémancey M, Martelli A, Riquier S, Guittet E, Latour JM, Puccio H, Drapier JC, Lescop E, Bouton C. (2014) J Biol Chem. Oct 10 ;289(41):28070-86.

Étude RMN du récepteur RCPG BLT2.

Nous nous intéressons avec JL Banères (IBMM) et L. Catoire (IBPC, Paris) à comprendre le lien qui peut exister entre l’état conformationnel des récepteurs couplés aux protéines G et le signal biologique transduit. Dans le contexte de l’ANR GHRDYN (2013-2016) et ALLOSIG(2017-2021), nous avons entrepris l’étude ambitieuse de caractériser par RMN des récepteurs RCGP : BLT2 est un récepteur couplé à une protéin G (RCPG) spécifique du leukotriène B4 ainsi que le récepteur à la ghréline. Pour cela des échantillons de récepteur marqués de manière optimale pour ce type d’objet (deutération suivie de marquage 13CH3 ou 13CHD2 des isoleucines et des méthionines) sont solubilisés dans des nanodisques. Nous avons montré que BLT2 existait dans un équilibre de plusieurs conformations. La fixation d’un agoniste mène à une redistribution partielle des conformations en faveur d’une conformation, dite pré-active. L’activité des RCPG est connue pour être sensible à la composition de la membrane, et de manière très intéressante, ici, l’augmentation de la concentration d’un analogue de cholestérol mène à une augmentation de l’activité et à une redistribution conformationnelle en faveur également de la conformation dite pré-active. Il semble donc que l’activation des RCPGs suite à la fixation d’un agoniste ou au changement de composition (et de flexibilité) de la membrane serait liée par une modification similaire de la surface d’énergie potentielle en faveur d’une même conformation pré-active.

Publications :

  • Casiraghi M, Damian M, Lescop E, Banères JL, Catoire LJ. (2018) Biochemistry ;57(16):2297-2307
  • Casiraghi M, Damian M, Lescop E, Point E, Moncoq K, Morellet N, Levy D, Marie J, Guittet E, Baneres JL, Catoire LJ. (2016) J Am Chem Soc. 138(35):11170-5.
  • Catoire LJ, Damian M, Giusti F, Martin A, van Heijenoort C, Popot JL, Guittet E, Banères JL. J Am Chem Soc. (2011) Jul 7 ;132(26):9049-57.
  • Catoire LJ, Damian M, Baaden M, Guittet E, Banères JL. (2011) J Biomol NMR. Jul ;50(3):191-5.

Étude de protéines intrinsèquement désordonnées interagissant et/ou régulant la polymérisation de l’actine.

L’actine est l’une des protéines les mieux conservées et la plus abondante du monde eucaryote. Elle existe sous une forme globulaire monomérique (actine-G) et sous une forme filamentaire (actine-F, constituant entre autre du cytosquelette). Sa dynamique d’association/dissociation et le remodelage constant de la structure de ses filaments sont centraux dans de multiples processus physiologiques (contraction musculaire, adhésion cellulaire, morphogénèse, motilité, trafic intracellulaire, invasion bactérienne, etc.) et donc aussi physiopathologiques (myopathie, syndrome néphrotique, invasion tumorale, etc.)

Ces processus sont étroitement contrôlés, dans le cytoplasme et dans le noyau, par une multitude de protéines se liant aux différentes formes d’actine (ABPs pour Actin Binding Proteins). Un grand nombre de ces ABPs sont des protéines multi-domaines, qui contiennent en particulier de larges régions désordonnées (IDRs pour Intrinsically Disordered Regions). Nous cherchons à mieux comprendre le rôle de ces IDRs au sein de ces ABPs. Nous nous sommes intéressés jusqu’à présent à des petits domaines protéiques de la famille WH2/Thymosine-beta qui existent seuls ou au sein de grosses protéines modulaires, et qui apparaissent souvent de manière répétée dans les ABPs. Ces domaines jouent des rôles très variés dans le contrôle de la polymérisation de l’actine, séquestration de l’actine monomérique, activation de la polymérisation au bout barbé des filaments, branchement des filaments, coupure des filaments, etc. Ils sont intrinsèquement désordonnés lorsqu’ils sont isolés en solution et se structurent au contact de l’actine et/ou au sein de protéines modulaires dans lesquelles ils jouent souvent un rôle de régulateur des interactions.

Nous avons décortiqué dans un premier temps le lien entre les séquences primaires de domaines WH2 agissant de manière isolés. Nous avons mis en évidence le fait que la combinaison de différents éléments répartis tout le long de leur séquence permettent de réguler finement l’affinité et la spécificité des interactions avec l’actine. Parmi ces éléments, nous avons montré le rôle clé de la présence ou non d’une charge située au centre de la séquence, qui permet le contrôle de la flexibilité de la partie C-terminale du domaine WH2 au sein du complexe avec l’actine, expliquant ainsi le contrôle de sa fonction de séquestration de l’actine monomérique ou d’activateur de la polymérisation de l’actine au bout barbé du filament (Didry D, Cantrelle FX et al. 2012). Tout en continuant à étudier plus en détail les mécanismes d’interaction de ces petites protéines intrinsèquement dépliées avec l’actine monomérique, nous cherchons maintenant à mieux comprendre la multiplicité de fonctions des domaines WH2 apparaissant de manière répétée au sein de protéines modulaires.

Publications :

  • Domanski, M., Hertzog, M., Coutant, J., Gutsche-Perelroizen, I., Bontems, F., Carlier, M.-F., Guittet, E., and van Heijenoort, C. (2004) Journal of Biological Chemistry 279, 23637-23645
  • Hertzog, M., van Heijenoort, C., Didry, D., Gaudier, M., Coutant, J., Gigant, B., Didelot, G., Préat, T., Knossow, M., Guittet, E., and Carlier, M.-F. (2004) Cell 117, 611-623
  • Carlier, M.-F., Hertzog, M., Didry, D., Renault, L., Cantrelle, F-X., van Heijenoort, C., Knossow, M., and Guittet, E. (2007) Annals of the New York Academy of Sciences 1112, 67-75
  • Delaroche, D., Cantrelle, F.X., Subra, F., Van Heijenoort, C., Guittet, E., Jiao, C.Y., Blanchoin, L., Chassaing, G., Lavielle, S., Auclair, C., Sagan, S. (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 7712-7721
  • Husson, C., Cantrelle, F.X., Roblin, P., Didry, D., Le K.H., Perez, J., Guittet, E., Van Heijenoort, C., Renault, L., Carlier, M.F. (2010) Annals of the New York Academy of Sciences 1194 ; 44-52
  • Didry D, Cantrelle FX, Husson C, Roblin P, Moorthy AM, Perez J, Le Clainche C, Hertzog M, Guittet E, Carlier MF, van Heijenoort C, Renault L. (2012) EMBO J., 31(4):1000-13
  • Renault L, Deville C, van Heijenoort C. (2013) Cytoskeleton, 70(11):686-705.
  • Deville C, Girard-Blanc C, Assrir N, Nhiri N, Jacquet E, Bontems F, Renault L, Petres S, van Heijenoort C. FEBS Lett. 2016 Oct ;590(20):3690-3699.

Désordre de l’hème et réactivité dans la neuroglobine humaine.

La neuroglobine (Ngb) est une globine découverte en 2000 dans les cellules nerveuses et la rétine de vertébrés et est étudiée par l’équipe de Pierre Sebban (LCP, Orsay). Les neuroglobines de mammifères (mais non de rongeur) diffèrent des autres globines par la présence de deux cystéines qui peuvent former un pont disulfure. Dans la neuroglobine humaine l’hème peut adopter deux orientations du fait de la pseudo-symétrie de l’hème, qui sont facilement distinguables par RMN. Nous avons récemment démontré que la cinétique de fixation du cyanure au FeIII, ce qui est supposé mimer la fixation du CO au FeII, était très différente pour ces deux orientations et que l’état d’oxydation des cystéines ou la mutation de certains résidus dans une boucle affectaient profondément ces cinétiques. La dynamique de la boucle est susceptible de jouer un rôle important dans la stabilité de la liaison histidine-Fe. Cette étude a été publiée récemment.

Publications :

  • Bocahut A, Derrien V, Bernad S, Sebban P, Sacquin-Mora S, Guittet E, Lescop E. (2013) J Biol Inorg Chem. ; 18(1):111-22
  • André E, Derrien V, Sebban P, Assrir N, Lescop E, Bernad S. J Biol Inorg Chem. (2019)