Prestations proposées par la plateforme

La plateforme vous propose différents tests en thermal Shift Assay pour votre protéine en fonction des paramètres que vous souhaitez étudier :

  • Test de faisabilité et optimisation.
  • Criblage de tampons pour thermostabilité optimale.
  • Etude de thermostabilité en fonction du pH.
  • Influence de mutations et délétions sur la thermostabilité.
  • Mesure des interactions protéine•ligands.
  • Criblage et optimisation des interactions ligands.
  • Mesure de stabilité en cinétique à différentes températures.
  • Etude d’interaction protéine•peptide ou protéine•protéine.
  • Mesure de stabilité d’assemblage protéines•acides nucléiques et particules virales.

Afin de vérifier la compatibilité de votre échantillon avec les tests proposés en Thermal Shift Assay, le test de faisabilité et optimisation devra être réalisé pour toutes nouvelles protéines avant les autres prestations proposées par la plateforme. En effet, cette première étape déterminera la faisabilité du projet pour les autres prestations souhaitées.

PLATEFORME CTPF

Responsable : Eric Jacquet (01 69 82 46 24)
Ingénieur Plateforme : Naima.Nhiri

Test de faisabilité et optimisation

Ce test est nécessaire pour toute nouvelle protéine étudiée par cette technique sur notre plateforme. Ce test à pour objectif de vérifier que l’échantillon de protéine est adapté à cette application. Il nous permettra de déterminer les concentrations optimales en protéine et en réactif fluorescent. Il est conseillé de faire ces premiers tests de thermostabilité dans le tampon de conservation de la protéine, quelques millilitres de ce tampon devrait donc également être fourni.

Criblage de tampons

L’objectif est de déterminer les conditions les plus favorables pour une meilleure thermostabilité d’une protéine. La valeur de la température de dénaturation de la protéine sera  mesurée dans différentes conditions de pH, tampon, sel…Nous proposons un modèle de microplaque de 48 conditions pré-établies en duplicat. Ces conditions comprennent 4 conditions de tampon (TrisHCl pH 8,5 ; Phosphate pH 7,5 ; Hepes pH 7,0 ; MES pH 6,0) avec des concentrations variables en NaCl, KCl, MgCl2 et Glycérol. Des conditions particulières pourront être préparées à la demande. La quantité de protéine nécessaire pour la réalisation de cette offre sera déterminée lors du test de faisabilité.

Thermostabilité en fonction du pH

L’objectif de ce test est de déterminer plus précisément la valeur optimale de pH conférant une meilleure thermostabilité de la protéine. Pour ces expériences, nous proposons l’utilisation de différents systèmes de tampon à 3 composants permettant de tester dans chaque système une gamme allant de pH 4 à pH 10 sur 10 à 20 valeurs différentes de pH dans la gamme étudiée. La quantité de protéine nécessaire pour la réalisation de cette offre sera déterminée lors du test de faisabilité.

Influence de mutations

Des modifications ponctuelles ou délétions de résidus peuvent affecter fortement la thermostabilité de ces protéines. Des expériences comparant les profils de dénaturation, permettent d’évaluer rapidement l’impact de ces mutations sur la structure, l’exposition de régions hydrophobes et la stabilité thermique dans différentes conditions expérimentales. La quantité de protéine nécessaire pour la réalisation de cette offre sera déterminée lors du test de faisabilité.

Interactions protéine•ligands : caractérisation et criblage

Le TSA permet de mettre en évidence des interactions protéines•ligand, ces interactions modifient la thermostabilité de la protéine par formation d’un complexe plus stable. Des variations de l’ordre de 2 à 20 °C de la température de dénaturation peuvent être observées selon la nature et l’affinité de cette interaction. Le déplacement de la courbe de dénaturation pourra être mesuré en fonction de concentrations croissantes de substrats ou d’inhibiteurs. Cette technique est également de première importance pour des projets de criblage de molécules pour la recherche de nouveaux ligands.

Cinétique de dénaturation

Ces expériences permettent la mesure de la conservation d’une structure native de la protéine, à une température donnée sur des temps longs. Elles permettent donc de sélectionner les conditions de tampons favorables pour conserver cette protéine sous sa forme native. L’expérience comprend 2 phases différentes : la phase d’incubation à température constante suivie d’une cinétique de dénaturation qui confirme l’état natif ou non des protéines après l’incubation de plusieurs heures. La température d’incubation et la durée de l’expérience seront adaptées selon les projets.

Etude de macro-complexes

Nous développons également sur la plateforme l’étude par Thermal Shift Assay de macro-complexes protéiques et la stabilité de particules virales. Plusieurs modèles de phages ont déjà été testés et validés, dans le cadre de collaboration avec des équipes de recherche, pour les mesures de stabilité des capsides ou phages par TSA.