Prestations proposées par la plateforme

 

La plateforme peut prendre en charge les différentes étapes de votre projet :

  • Aide à la conception et au design du projet.
  • Préparation des échantillons.
  • Dosage et contrôle qualité des échantillons.
  • Contrôle de non contamination.
  • Transcription inverse.
  • Design et optimisation des couples en SybrGreen.
  • Sélection ou design de sondes TaqMan.
  • Design et commande des TaqMan Array Cards.
  • Réaction de qPCR en microplaque, TaqMan Array Card ou Open Array.
  • Analyse et sélection des gènes de référence.
  • Analyse, traitement des données et calcul des variations d’expression du projet de qPCR.

PLATEFORME QPCR

Responsable : Eric Jacquet (01 69 82 46 24)
Ingénieur Plateforme : Naima.Nhiri

Préparation des échantillons

Broyage et extraction

Pour la préparation d’échantillons à partir de tissus ou organes, il sera nécessaire de réaliser un broyage. Ce broyage sera réalisé sur billes céramiques à l’aide du Precellys 24 avec réfrigération Cryolys dans des tubes à usage unique. Si besoin l’extraction pourra être faite dans le Trizol pour améliorer les rendements.

Purification ARN

La purification des ARN sera effectuée sur colonne à l’aide de kit Macherey-Nagel ou Qiagen. La purification pourra être automatisée sur automate Qiacube selon les projets. Les extractions faites par broyage dans le Trizol seront systématiquement repurifiées sur colonne avec les kits.

Dosage et contrôle qualité

La concentration des échantillons purifiés sera mesurée au Nanodrop ou au Qubit. Le contrôle qualité des ARN sera réalisé sur puce Bioanalyseur 2100 Agilent. La mesure de l’intégrité des ARN purifiés est nécessaire avant utilisation des échantillons pour les réactions de PCR quantitative. La prestation inclut la préparation des puces RNA 6000 Nano ou RNA 6000 Pico, avec dépôt des échantillons en simplicat et certains échantillons en duplicat. Analyse des profils et vérification des indices de qualité des préparations d’ARN (RIN).

Transcription inverse

L’étape de transcription inverse permet la préparation des cDNA à partir des échantillons ARN purifiés. Le choix du protocole et du kit de reverse transcription se fera en fonction des besoins du projet.

 

Prestations de PCR quantitative

Design et validation des couples d’oligonucléotides

Pour les projets de PCR quantitative en SybrGreen, notre équipe se propose de faire le design de vos primers et de les commander pour vous. Les prestations incluent l’optimisation des couples et la mesure de l’efficacité des réactions de QPCR. Un minimum de 1 couple d’oligonucléotides est designé pour chaque gène cible et chaque gène de référence. Certains gènes nécessiteront de designer plusieurs couples pour sélectionner le meilleur en spécificité et en efficacité.

Sélection et design des sondes TaqMan

Les projets de PCR quantitative en sonde individuelle TaqMan pourront être développés en utilisant des sondes TaqMan inventoriées ou commandées à façon. Les sondes TaqMan des gènes de référence sont disponibles sur la plateforme.

QPCR Sybr Green et TaqMan en microplaque (moyen-débit)

Les projets développés en SybrGreen seront réalisés en microplaque 384 sur le QuantStudio 12K. Pour chaque projet des courbes d’efficacité interne des couples d’amorces et des contrôles négatifs de non contamination seront ajoutés dans le plan de l’expérience.

QPCR en TaqMan Array Card (haut-débit en microvolume)

La plateforme dispose d’un 7900HT robotisé permettant la réalisation des projets en sondes TaqMan à haut-débit en utilisant des cartes microfluidiques (TaqMan Array Card). L’utilisation de ces cartes permet de déterminer rapidement le profil d’expression d’un grand nombre de gènes sur plusieurs échantillons. Les cartes sont préchargées en sonde TaqMan permettant de mesurer simultanément l’expression de 16 à 384 gènes (gènes de référence et gènes d’intérêt). Cette technique très sensible, reproductible et robotisée, permet de réaliser jusqu’à 5000 dosages par jour en utilisant des volumes de 1 µL par réaction. Un accompagnement pour le design des TaqMan Array Card est assuré par l’équipe de la plateforme. Le design et la commande des TaqMan Array Cards peut également être pris en charge par la  plateforme.

QPCR en Open Array Plate (très haut-débit en nanovolume)

Pour les exigences de projets d’études de transcriptome à très-haut débit, la plateforme est équipée d’un appareil de QPCR de nouvelle génération. La plateforme dispose d’un QuantStudio 12K Flex équipé d’un bloc Open Array et de son robot de chargement AccuFill. Cet appareil permet de traiter jusqu’à 12 000 QPCR par run de 2H00 dans un volume réactionnel de 10 à 33nL. Les performances de ce type d’équipement sont adaptées aux projets de criblage nécessitant l’analyse de plusieurs centaines d’échantillons ou de gènes cibles.

Analyse, normalisation et traitement des données

Les données des projets de PCR quantitative seront analysées par le personnel de la plateforme. Ces analyses comprennent : qualité des courbes d’amplification, export des valeurs brutes, analyse des valeurs de Ct et des réplicats techniques, calcul des moyennes de groupes, recherche et sélection des meilleurs gènes de référence par les logiciels GeNorm et NormFinder, calcul des variations d’expression entre échantillons.